第三代测序技术是指单分子测序技术，在测序过程中不需要经过PCR扩增，实现对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有反应速度快、超长读长，无模板扩增、直接检测表观修饰位点、测序错误随机出现，没有GC或修饰的偏好性等特点。诺赛基因主要应用的测序平台为是Pacific Biosciences (PacBio) 公司的单分子实时测序技术平台和Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的单分子纳米孔测序技术平台。这两个大平台也是目前最有代表性的三代测序平台。
2） 全基因组测序
3） 全长转录组测序
4） 甲基化测序(具体项目请先咨询）
（1）单分子测序,大大提高了样本的通量和检测的速度；
（2）RNA直接测序，大大降低了体外逆转录产生的系统误差；
（3）长片段测序，大大提高DNA聚合酶内在自身的延续性（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段）。
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PacBio Sequel 测序平台
随着测序技术的不断推进，以PacBio为代表的第三代基因测序技术逐渐应用到多个科研领域。该平台是美国太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）基于纳米小孔的单分子读取技术，又称作单分子实时测序技术（SMRT，Single Molecule Real-Time），无需扩增即可快速完成序列读取。
PacBio Sequel测序仪是2015年10月推出全新升级的第三代测序平台，该系统较上一代RSII平台测序体积减少2/3、通量提高7倍、单Gb数据成本更低、测序周期更短。2019年4月，该公司重磅发布新一代测序系统PacBio SequelⅡ，与PacBio Sequel测序系统相比，PacBio SequelⅡ芯片支持8M SMRT Cell ，单张芯片测序通量提升了8倍，并可产出高精准度的长读长HiFi reads，碱基准确度可达99.9% 以上，具有测序通量更高、耗时更短、准确度更高、应用更灵活等特点。
SMRT技术应用了边合成边测序的思想，将测序文库、DNA聚合酶以及四色荧光基团标记的dNTP放置在ZMW孔（即零模波导孔Zero-Mode Waveguides）底部，进行单个DNA分子的合成反应。在测序过程中，以SMRT芯片为测序载体，以共价结合方式固定的DNA聚合酶和测序模板相结合，根据模板链核苷酸顺序，对应的dNTP加入发生链延伸反应，通过检测4种dNTP的荧光信号，以及荧光的波长与峰值分析获得DNA的碱基序列。
平均读长10-15Kb，最长可达40-70Kb，通量~80 Gb/cell，较二代测序平台读长更长，有效解决短序列数据的拼接难题，且时间更短；在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列覆盖的完整性和均一性。建库过程中，DNA不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR冗余。
（1）全基因组de novo测序
（2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
（3）全长转录本测序
（4）宏基因组测序
（5）16S rDNA全长测序
（6）细胞器基因组测序
（7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
（8）表观遗传学
（1）高质量总RNA(DNA)的制备；
（2）SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit （Clontech）反转录，将 RNA 反转录成 cDNA，并加接头序列(DNA直接加接头）；
（3）文库构建（即环化）；
（4）上机测序。
Nanopore测序平台
Nanopore平台是牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，简称ONT）研发的新兴实时单分子纳米孔测序技术平台。用于Nanopore平台测序的DNA或RNA建库过程简单直接，最快的建库方法只需5到10分钟就可在样本分子末端添加测序接头及马达蛋白。具有测序通量更高、耗时更短、准确度更高、应用更灵活等特点。所有Oxford Nanopore测序设备使用同样的核心技术，用户可以轻松根据应用测试实验以及扩大或缩小规模。从最小型的Flongle和掌上MinION，到桌面型的GridION和PromethION。所有设备都可用于进行按需测序实验。包括从单次试验到超高通量项目，全部都可提供快速、长读长、实时的DNA或RNA直接测序。
ONT测序平台通过电信号识别碱基序列。当DNA/RNA单链通过纳米孔时，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号，通过对这些信号检测，可获得相应碱基类型，完成测序。
1. 解螺旋，将双链DNA解开成单链；
2. DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子；
3. 进入纳米孔的单分子引起特征性的电流干扰，不同的DNA单分子停留在孔道中就会形成特征性离子电流变化信号， 带来电流不同的变化；
4.不同的碱基带来的电流变化是不同的， 转化器蛋白分子可以感受每个碱基的电流变化。
5. 根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。
理论读长无限长，试剂读长受样品的实际文库长度限制，DNA/RNA直接测序，目前报到处DNA片段长度最高记录为>2 Mb，直接RNA测序读长最长为26kb，MinION通量为20Gb/cell，GridION X5 通量为50-100Gb/cell，PromethION通量为Tb级；文库制备简单快速，10 分钟文库制备；多种型号可选择，扩增性更强；MinION较Pacbio测序平台体积小，更便协调、易操作；结构变异的检测更有优势；可对RNA进行表达分析。
（1）全基因组de novo测序
（2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
（3）全长转录本测序
（4）宏基因组测序
（5）16S rDNA全长测序
（6）细胞器基因组测序
（7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
（8）表观遗传学
Nanopore测序实验流程：
（1）高质量总DNA提取；
（2）建库主要是需要给待测DNA两侧先加上A碱基，使平末端变成黏性末端，然后再加上Y接头以及马达蛋白；
（3）上机测序。
测序方案
MinION：
无需等待的即时测序
能在实验室外进行实地测序
达到每48 小时10-20 Gb数据量
MinIno平台
特点：袖珍型、便携式生物分析设备
多达 512 个纳米孔通道
样本制备只需10 分钟，简单快捷
实时分析，工作流程快速高效
适用于 DNA 或 RNA 直接测序
GridION X5：
从事较大的测序项目， 有5 个 MinION 测序芯片（每 48 小时 50-100Gb 数据量）
直接在测序仪上进行碱基序列读取——无需辅助设施。
PromethION：(暂不提供此平台的服务）
具有庞大数据量的项目 (Tb)
能对大量样本进行按需测序服务
高通量、高样本数的台式系统
模块化设计：多达 48 个测序芯片，各有多达 3,000 个纳米 孔通道（总计达 144,000 个）
测序芯片既可单独也可同时运行
应用于大容量样品测序，工作流程与 MinION相同
1.样品质检流程是怎样的？
DNA检测：Nanodrop检测→Qubit检测→琼脂糖凝胶电泳检测；
RNA检测：Nanodrop检测→琼脂糖凝胶电泳检测→Agilent 2100检测；
文库检测：Qubit检测→Caliper/NGS3K/Agilent 2100检测→QPCR定量检测。
2.文库的最适插入片段长度范围？
PE150平台：DNA 350 bp；PE250平台：270~470 bp; RNA 250~300 bp;SE50平台： <530 bp（以上片段均指不包含接头序列的插入片段长度）；
实际文库制备时，HiSeq文库大小介于300bp-500bp之间；MiSeq文库大小介于300 bp-600 bp之间；鸟枪法建库时，文库应小于1000bp。
3.自建库有哪些注意事项？
（1）需要客户提供文库体积及初步检测的浓度，并满足送样要求；
（2）需提供建库接头详细正确的序列信息以及正向无误的index序列，以确保文库能在测序仪顺利上机以及保证后续数据正常拆分。
4.16S测序哪个区域比较合适？
目前并没有绝对的研究表明哪个测序区域更好。根据比较权威的研究表明土壤样本，16S V4区（515F-806R）比较适合做扩增子研究，可检测的物种多样性更丰富，并且可重复性强（PNAS. 2013. 110(16): 6548-6553.）。Illumina官方推荐的是V3+V4区。
5.若关注环境中的真核微生物多样性，ITS测序和18S测序哪个更好？
ITS测序主要是针对真菌多样性的研究，注释准确度高；18S测序针对的是真核微生物，注释到的范围广，但是就真菌来说精确度相对较低；可根据研究目的合理选择测序方案。
6.扩增子与宏基因组的区别？
扩增子主要分为16S、18S、ITS测序，关注环境样本中的物种组成，该技术物美价廉，实用性高。宏基因组关注环境样本中的物种组成、功能组成及代谢通路等信息，该技术深入挖掘环境样本功能层面的信息。
7..宏基因组与微生物多样性的区别？
宏基因组将基因组DNA随机打断成若干条小片段，然后在片段两端加通用引物进行PCR扩增测序，将得到的reads进行组装后进行基因预测得到基因序列，众多基因构成环境中微生物的基因集。
微生物多样性主要针对核糖体小亚基基因序列进行测序（16s rDNA或者18s rDNA），该基因既存在高度保守的区域还包括高变区，通过特异性引物对某一段高变区（如V4区）或某几段高变区（如V3-V4区）进行扩增测序，然后与数据库比对，可特异性识别细菌种类。
总的来说，微生物多样性主要告诉我们环境里有什么微生物，而宏基因组主要告诉我们环境里的微生物能做什么。
8.为什么宏基因组与微生物多样性物种注释结果存在差异？
微生物多样性和宏基因组都会分析环境中物种的种类，但是物种的丰度在二者之间存在一定的差异： 第一种原因是微生物多样性是基于核糖体小亚基基因序列进行物种注释和丰度统计，但是在不同物种中核糖体基因的拷贝数不一样，这会带来一些误差；第二种原因是二者在建库测序过程中会进行PCR反应，在PCR这个过程中也会存在一些误差。
